1. Si recibo un tubo de células congeladas, ¿puedo ponerlo directamente en nitrógeno líquido para almacenarlo?
En muchos casos, las células transportadas en hielo seco (-80 °C) pueden volver a colocarse en nitrógeno líquido y luego descongelarse rápidamente.Sin embargo, la viabilidad celular puede reducirse después de tal tratamiento.Para algunas líneas celulares sensibles, esto puede dificultar la recuperación celular.Se cree que este fenómeno se debe a un cambio en la estructura de los cristales de hielo dentro de las células como resultado del cambio de temperatura.Por lo tanto, se recomienda que las células se descongelen y cultiven lo antes posible después de recibirlas.Reducir el tiempo de almacenamiento a -80°C.Esta temperatura solo se utiliza para el transporte.
2. ¿Qué medidas de seguridad deben tomarse al retirar las células del nitrógeno líquido para su recuperación?
Los criotubos de células en nitrógeno líquido que no están completamente sellados y tienen fugas de nitrógeno líquido en ellos pueden causar una explosión si la temperatura del criotubo aumenta bruscamente al descongelarse.Por lo tanto, se recomienda usar gafas protectoras y guantes protectores al extraer las células del nitrógeno líquido.Para la reanimación, el tubo de congelación debe agitarse continuamente en un baño de agua a 37 °C para descongelar completamente la solución de congelación en 1 o 2 minutos.Luego, limpie el exterior del tubo con una toallita con alcohol, luego llévelo a la mesa ultra limpia y transfiera las células a un tubo de centrífuga con 10 ml de medio de cultivo agregado, centrifugue a 1000 rpm durante 5-10 minutos, deseche el sobrenadante, agregue la cantidad apropiada de medio de cultivo e inocule el matraz de cultivo e incube en una incubadora con CO2 al 5%.
3. ¿Por qué las células deben almacenarse en la fase de vapor de un tanque de nitrógeno líquido en lugar de en la fase líquida?
Las células almacenadas en la fase gaseosa del nitrógeno líquido tienen más probabilidades de revivir.Mientras que en la fase líquida del nitrógeno líquido, si los tubos de liofilización no están debidamente sellados o presentan fugas, el contacto directo entre las células y el nitrógeno líquido puede comprometer la viabilidad de las células después de la descongelación.
4. Para las células en suspensión, ¿cómo cambio el medio de cultivo?
El cultivo de células en suspensión se puede realizar simplemente agregando medio nuevo (si el espacio lo permite) o separando las células del medio antiguo mediante centrifugación (100 xg durante 5 minutos) y luego resuspendiendo las células precipitadas en medio nuevo.Sin embargo, para la mayoría de las líneas de células en suspensión, simplemente agregar medio es un mejor método.De cualquier manera, el medio debe renovarse antes de que las células alcancen su mayor densidad de saturación.La densidad de saturación de las células varía entre 3 x 10 5 y 2 x 10 6 dependiendo de la línea celular y las condiciones de cultivo (reposo o agitación, niveles de oxigenación, etc.).Las células deben diluirse a una concentración de células más baja para permitir la recuperación de nutrientes suficiente para mantener las células creciendo logarítmicamente.Si simplemente se cambia el medio sin reducir la densidad celular, las células agotarán rápidamente el medio y morirán.Si las células se diluyen por debajo de su densidad más pequeña, entrarán en una fase de retraso y crecerán muy lentamente o morirán.Cada línea de células en suspensión tiene una densidad de saturación y un intervalo de pases diferentes, por lo que los recuentos diarios de células son la forma de monitorear las líneas de células en suspensión*.
5. ¿Cuál es el nivel de CO2 recomendado para el cultivo celular?
Aunque los niveles de CO2 en los sistemas de cultivo celular oscilan entre el 0,03 % y el 40 % (normalmente alrededor del 0,03 % de CO2 en la atmósfera), es muy común no añadir CO2 al aire o una concentración de CO2 del 5 % al 10 %.Es importante ajustar la concentración de bicarbonato de sodio en el medio para equilibrarla con el nivel de CO2 en la fase gaseosa.Las células producen CO2 y requieren una pequeña cantidad de ácido carbónico para crecer y sobrevivir.Si no se agrega CO2 y las células se multiplican, se pueden usar 4 mM (0,34 g/L) de bicarbonato de sodio anhidro.Sin embargo, la tapa del matraz de cultivo debe apretarse en este punto.Si el sistema de cultivo requiere 5% o 10% de CO2, use bicarbonato de sodio 23,5 mM (1,97 g/L) o 47 mM (3,95 g/L) a 37 °C, respectivamente, con un pH inicial de aproximadamente 7,6.En estas condiciones, el matraz debe dejarse destapado o debe utilizarse una placa de Petri para mantener el equilibrio de los gases.
6. ¿Por qué algunas células necesitan piruvato de sodio?¿Cuánto piruvato de sodio debo agregar al medio?
El piruvato es un metabolito de ácido orgánico en la vía glucolítica* que entra y sale fácilmente de la célula.Por lo tanto, la adición de piruvato de sodio al medio proporciona tanto una fuente de energía como una fuente de carbono para el anabolismo, ayuda a mantener ciertas células específicas, ayuda con la clonación celular o es necesario cuando se reducen las concentraciones séricas en el medio.El piruvato de sodio también ayuda a reducir la citotoxicidad inducida por fluorescencia.El piruvato de sodio generalmente se agrega a una concentración final de 1 mM.Las soluciones de piruvato de sodio comercialmente disponibles suelen ser una solución de almacenamiento 100 mM (100X).
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Hora de publicación: 21-jun-2022