La PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real es un método para medir la cantidad total de producto después de cada ciclo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en una reacción de amplificación de ADN usando un fluoróforo.El método se utiliza para cuantificar secuencias de ADN específicas en la muestra que se analizará mediante métodos de referencia internos o externos.Desde sus inicios, los ensayos de PCR cuantitativa fluorescente se han vuelto cada vez más populares entre los profesores de laboratorio.
Principio de PCR por fluorescencia: La PCR por fluorescencia, primero llamada TaqManPCR y más tarde también Real-TimePCR, es una nueva técnica de cuantificación de ácidos nucleicos desarrollada por PE (PerkinElmer) en los EE. UU. en 1995. La técnica se basa en la adición de una sonda marcada con fluorescencia o correspondiente colorante fluorescente a PCR convencional para lograr su función cuantitativa.El principio: a medida que avanza la reacción de PCR, los productos de la reacción de PCR se acumulan y la intensidad de la señal fluorescente aumenta en igual proporción.Con cada ciclo, se recopila una señal de intensidad de fluorescencia para que podamos monitorear el cambio en la cantidad de producto por el cambio en la intensidad de fluorescencia y así obtener un gráfico de curva de amplificación de fluorescencia.
En general, la curva de amplificación de fluorescencia se puede dividir en tres fases: la fase de señal de fondo de fluorescencia, la fase de amplificación exponencial de señal de fluorescencia y la fase de meseta.Durante la fase de señal de fondo, la señal de fluorescencia amplificada queda enmascarada por la señal de fondo de fluorescencia y no se pueden determinar los cambios en la cantidad de producto.En la fase de meseta, el producto de amplificación ya no aumenta exponencialmente, no existe una relación lineal entre la cantidad de producto final y la cantidad de plantilla inicial, y el número de copias de ADN inicial no se puede calcular en función de la cantidad de producto de PCR final.Solo en la fase de amplificación exponencial de la señal fluorescente existe una relación lineal entre el logaritmo de la cantidad de producto de PCR y la cantidad de plantilla inicial, y podemos optar por cuantificar esto en esta etapa.Para facilitar la cuantificación y la comparación, se han introducido dos conceptos muy importantes en la técnica de PCR cuantitativa fluorescente en tiempo real: el umbral de fluorescencia y el valor de CT.
El umbral es un valor establecido artificialmente en la curva de amplificación de fluorescencia.fase exponencial de la amplificación por PCR.
Valor Ct: es el número de ciclos que ha sufrido la señal de fluorescencia en cada tubo de reacción para alcanzar el valor de dominio establecido.
La relación entre el valor Ct y la plantilla inicial: los estudios han demostrado que el valor Ct de cada plantilla tiene una relación lineal con el logaritmo del número de copia inicial de esa plantilla, cuantas más copias del número de copia inicial, menor es el Ct valor.Los valores de Ct son relativamente estables.Se puede hacer una curva estándar usando un estándar con un número de copia inicial conocido, donde la coordenada horizontal representa el logaritmo del número de copia inicial y la coordenada vertical representa el valor Ct como se muestra en la figura a continuación.
Por lo tanto, al obtener el valor Ct de una muestra desconocida, el número de copias inicial de esa muestra se puede calcular a partir de la curva estándar.
El valor de Ct no es constante y puede verse influenciado por diferentes muestras y diferentes instrumentos, incluso si la misma muestra se repite 2 veces en el mismo instrumento, el valor de Ct puede variar.
Ensayos cuantitativos de fluorescencia: los ensayos cuantitativos de fluorescencia se pueden dividir en sondas fluorescentes y tintes fluorescentes según los marcadores utilizados.Las sondas fluorescentes incluyen tecnología Beacon (tecnología de baliza molecular, representada por American Tagyi), sondas TaqMan (representadas por ABI) y tecnología FRET (representada por Roche);los tintes fluorescentes incluyen tintes fluorescentes saturados y tintes fluorescentes no saturados, el representante típico de los tintes fluorescentes no saturados es SYBRGreen I, que se usa comúnmente ahora;saturado El representante típico de los colorantes fluorescentes no saturados es SYBRGreenⅠ;los colorantes fluorescentes saturados son EvaGreen, LCGreen, etc.
SYBRGreenI es un colorante de unión al ADN de uso común para la PCR fluorescente, que se une de forma no específica al ADN de doble cadena.En su estado libre, SYBRGreenI emite una fluorescencia débil, pero una vez unido al ADN de doble cadena, su fluorescencia aumenta 1000 veces.Por lo tanto, la señal de fluorescencia total emitida por una reacción es proporcional a la cantidad de ADN de doble cadena presente y aumenta a medida que aumenta el producto de amplificación.
Ventajas de los tintes de unión a ADN de doble cadena: diseño experimental simple, solo se requieren 2 cebadores, no es necesario diseñar sondas, no es necesario diseñar múltiples sondas para realizar pruebas rápidas de múltiples genes, capacidad para realizar análisis de curvas de punto de fusión, probar la especificidad de la reacción de amplificación, bajo costo inicial, buena generalidad y, por lo tanto, más comúnmente utilizado en investigación en el país y en el extranjero.
Método de sonda fluorescente (técnica Taqman): cuando se realiza la amplificación por PCR, se agrega un par de cebadores junto con una sonda fluorescente específica.Cuando la sonda está intacta, la señal de fluorescencia emitida por el grupo informador es absorbida por el grupo extinguido y no es detectada por el instrumento de PCR;Durante la amplificación por PCR (en la fase de extensión), la actividad de escisión 5'-3' de la enzima Taq degrada la sonda enzimáticamente, haciendo que el grupo de fluorescencia informador y el grupo de fluorescencia extinguida
Aplicaciones de la PCR cuantitativa fluorescente.
Investigación en biología molecular:
1. Análisis cuantitativo de ácidos nucleicos.Análisis cuantitativo y cualitativo de enfermedades infecciosas, detección de microorganismos o virus patógenos, como la reciente epidemia de influenza A (H1N1), detección de números de copias de genes de plantas y animales transgénicos, detección de tasas de inactivación de genes RNAi, etc.
2. Análisis de expresión génica diferencial.Comparación de diferencias de expresión génica entre muestras tratadas (p. ej., tratamiento farmacológico, tratamiento físico, tratamiento químico, etc.), diferencias de expresión de genes específicos en diferentes fases y confirmación de microarrays de cDNA o resultados de expresión diferencial
3. Detección de SNP.La detección de polimorfismos de un solo nucleótido es importante para el estudio de la susceptibilidad individual a diferentes enfermedades o la respuesta individual a fármacos específicos, y debido a la ingeniosa estructura de las balizas moleculares, una vez que se conoce la información de la secuencia de un SNP, es fácil y preciso utilice esta técnica para la detección de SNP de alto rendimiento.
4. Detección de metilación.La metilación está asociada con muchas enfermedades humanas, especialmente el cáncer, y Laird informó una técnica llamada Methylight, que trata el ADN antes de la amplificación para que la citosina no metilada se convierta en uracilo y la citosina metilada no se vea afectada, utilizando cebadores específicos y sondas Taqman para distinguir entre ADN metilado y no metilado. .más sensible.
Investigación médica:
1. Diagnóstico prenatal: las personas no pueden tratar enfermedades hereditarias causadas por material genético alterado, y hasta ahora solo pueden reducir el número de bebés enfermos que nacen a través del control prenatal para prevenir la aparición de diversas enfermedades hereditarias.Este es un método no invasivo que es fácilmente aceptado por las mujeres embarazadas.
2. Detección de patógenos: el ensayo de PCR cuantitativa fluorescente permite la determinación cuantitativa de patógenos como gonococcus, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma solium, virus del papiloma humano, virus del herpes simple, virus de la inmunodeficiencia humana, virus de la hepatitis, virus de la influenza, Mycobacterium tuberculosis, EBV y citomegalovirus.Tiene las ventajas de alta sensibilidad, tamaño de muestra bajo, rapidez y simplicidad en comparación con los métodos de prueba tradicionales.
3. Evaluación de la eficacia de los medicamentos: el análisis cuantitativo del virus de la hepatitis B (VHB) y el virus de la hepatitis C (VHC) muestra que existe una relación entre la carga viral y la eficacia de ciertos medicamentos.Si el nivel sérico de ADN-VHB disminuye durante el tratamiento con lamivudina y luego aumenta nuevamente o supera el nivel anterior, es indicativo de una mutación del virus.
4. Pruebas oncogenéticas: aunque el mecanismo de desarrollo del tumor aún no está claro, se acepta ampliamente que las mutaciones en genes relevantes son la causa subyacente de la transformación oncogénica.Se puede observar una mayor expresión y mutación de oncogenes en las primeras etapas de muchos tumores.La PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real no solo es eficaz para detectar mutaciones en genes, sino que también puede detectar con precisión la expresión de oncogenes.Este método se ha utilizado para detectar la expresión de una variedad de genes, incluido el gen hTERT de la telomerasa, el gen WT1 de la leucemia granulocítica crónica, el gen ER oncogénico, el gen PSM del cáncer de próstata y genes virales asociados a tumores.
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Hora de publicación: 21-jun-2022